De grote hoefijzerneus gaat in winterslaap van september/oktober tot april. Ze hangen hierbij vrij aan het plafond, soms in dichte groepen. Tijdens de winterslaap omhullen de vleugels het gehele lichaam. Gedurende de winterslaap worden ze vaak wakker (tot twee keer per week). Als het weer niet te koud, te nat of te winderig is, jagen ze bij de ingang van de grot op voedsel. In het voorjaar verlaten ze hun winterverblijfplaats en gaan ze op zoek naar een zomerverblijfplaats. De afstand tussen hun zomer- en winterverblijf bedraagt gemiddeld zo'n 20 à 30 km. Op hun zomerverblijfplaats verenigen de vrouwtjes zich in kraamkolonies. De sexueel actieve mannetjes leven solitair of in kleine groepjes. 's Nachts verlaten ze hun kolonieplaats en gaan ze op jacht naar insecten.
De grote hoefijzerneus vliegt ongeveer een half uur na zonsondergang uit. Meestal vliegen ze vrij laag (0,3-6 m). Bij de jacht maken ze gebruik van echolocatie of sonar om zich te oriënteren en hun prooien te localiseren. Via hun neus stoten ze ultrasone, voor de mens onhoorbare, geluiden uit. Wanneer de geluidsgolven op een object (boom, insect...) botsen, dan ontstaat er een echo die wordt opgevangen door de gevoelige vleermuisoren. In de hersenen worden al deze signalen verwerkt en krijgt de vleermuis een 'beeld' van zijn omgeving. De grote hoefijzerneus kan de vorm van hun trechtervormige hoefijzerneus aanpassen en op die manier het geluid in een bepaalde richting bundelen. Ze zenden een signaal uit met een constante frequentie (CF).
Grote hoefijzerneuzen overwinteren hoofdzakelijk in diepe grotten of groeven waar een temperatuur heerst van 7-10°C. Ook in grote kelders worden ze al eens aangetroffen.
Voor de grote hoefijzerneus is een hoge temperatuur in de kraamkolonie zeer belangrijk voor de ontwikkeling van de jongen. In Vlaanderen verblijven de kolonies bijgevolg meestal op warme plaatsen zoals kerkzolders. De grote hoefijzerneus moet een grote invliegopening hebben die directe vlucht naar de kolonieplaats toelaat.
De grote hoefijzerneus foerageert in een straal van 5 km rond de kolonie. Tussen kolonieplaats en jachtgebied verplaatsen de dieren zich uitsluitend langs kleine landschapselementen. Een opening van meer dan 10 meter in de vegetatie is voldoende om een verbindingsroute ongeschikt te maken. Deze soort jaagt in structuurrijke loofbossen, boomgaarden en op de overgang tussen loofbos en permanente graslanden. De grote hoefijzerneus is gebonden aan kleinschalige landschappendoorsneden met verbindingselementen. De aanwezigheid van nachtrustplaatsen (grotten, verlaten gebouwtjes, schuilplaatsen voor het vee, ...) blijkt zeer belangrijk te zijn.
Het dieet van de grote hoefijzerneus bestaat hoofdzakelijk uit grote nachtvlinders en keversoorten, die hij in de vlucht opeet. Tussen mei en augustus eet hij met twee tot drie tussenpauzes, waarbij hij af en toe terugkeert naar een verblijfplaats vlakbij het jachtterrein. Te grote prooi eet deze soort op vaste voedingsplaatsen. Ook vangt hij wel eens prooi op de grond, bijvoorbeeld spinnen en kevers. Ook drinken doet de vleermuis in vlucht. In augustus en september kunnen ze de hele nacht wegblijven, waarbij ze zich voorbereiden voor de winterslaap.
De grote hoefijzerneus wordt pas in zijn 3de of 4de levensjaar sexueel actief. Normaal worden de jongen geboren tussen half juni en half juli. Na ongeveer drie weken zijn de jongen vliegvlug en nog eens vijf weken later zijn ze volledig zelfstandig. De paringen vinden plaats tijdens de herfstperiode in de winterverblijfplaatsen.