De Mopsvleermuis overwintert van oktober/november tot maart/april. De soort kan goed tegen kou, en overwintert vaak dicht bij de ingang. De dieren kruipen graag weg in spleten. De Mopsvleermuis is een middellange afstandstrekker tussen winter- en zomerverblijfplaats. Op hun zomerverblijfplaats verenigen de vrouwtjes zich in kraamkolonies, bestaande uit 5 tot maximaal 30 dieren. De mannetjes leven solitair of in kleine groepjes.
De mopsvleermuis vliegt soms al voor zonsondergang uit. Mopsvleermuizen jagen boven open plaatsen in een bos, vlak boven het water of bij boomtoppen. Hij vliegt niet de gehele nacht door, waarschijnlijk zijn er twee activiteitspieken in de nacht. Bij de jacht maken ze gebruik van echolocatie of sonar om zich te oriënteren en hun prooien te localiseren. Via hun mond stoten ze ultrasone, voor de mens onhoorbare, geluiden uit. Wanneer de geluidsgolven op een object (boom, insect...) botsen, dan ontstaat er een echo die wordt opgevangen door de gevoelige vleermuisoren. In de hersenen worden al deze signalen verwerkt en krijgt de vleermuis een 'beeld' van zijn omgeving. De dwarsoorvleermuis of mopsvleermuis stoot tijdens de jacht geluiden uit tussen de 25 en 35 khz en tussen de 60 en 75 khz. Er is dus een korte periode uit met een constante frequentie (CF), afgewisseld met een steile frequentie modulerende sonar (FM). Dit laatste zijn korte pulsen met een steil frequentie verloop. Dit wil zeggen dat in een korte tijd de frequentie van 100 kHz zakt tot 30 kHz. Dit type van signaal geeft zeer gedétailleerde informatie, maar door de weerstand van de lucht reikt het niet ver.
Mopsvleermuizen overwinteren grotten, forten, bunkers en ijskelders. Daar prefereren ze de meer open, vaak tochtige gedeeltes met een lage temperatuur van 0°-5°C.
De mopsvleermuizen maken hun zomerverblijf (kraamkamer) in spleten van gebouwen (vaak achter vensterluiken) en in boomholten. Ze maken soms ook gebruik van vleermuiskasten.
De mopsvleermuis is een onopvallende soort. Ze worden voornamelijk aangetroffen in bosrijke, heuvelachtige gebieden. De soort lijkt ook sterk gebonden aan moerassige gebieden.
Het dieet van de mopsvleermuis bestaat bijna uitsluitend uit nachtvlinders. De dieren hebben een kleine mondopening en zwakke, kleine tanden waardoor zij genoodzaakt zijn zachte insecten te eten, insecten met harde dekschilden staan dus niet op hun menu.
De mopsvleermuis zijn geslachtsrijp in hun 2de levensjaar. De jongen worden geboren rond 15 juni Veelal krijgt elk vrouwtje 2 jongen. De paringen vinden plaats tijdens het najaar en de winter.