Watervleermuizen overwinteren in forten en mergelgroeven. Gewoonlijk zitten ze in spleten gedrukt maar je kan ze ook in grote groepen van soms meer dan 100 dieren aan de wand vinden. De winterslaap begint omstreeks september. Vanaf begin maart zijn de eerste watervleermuizen weer actief. De watervleermuis is een middellange-afstandtrekker die tussen de 10 en 100 km aflegt tussen winter- en zomerverblijfplaats. Omstreeks april trekken de vrouwtjes naar de kraamkolonies. De kolonie verhuist gemiddeld om de drie dagen. Tijdens de kraamperiode blijven ze langer ter plaatse.
Een half uur tot een uur na zonsondergang vliegen ze uit en ongeveer een uur voor zonsopgang keren ze terug. Tussen de verblijfplaats en het jachtgebied hebben ze vaste vliegroutes. Ze jagen vaak maar 20 tot 50 cm boven het wateroppervlak (zowel stilstaand als stromend water), maar soms ook tot op 5 m hoogte rond bomen.
Bij de jacht maken ze gebruik van echolocatie of sonar om zich te oriënteren en hun prooien te localiseren. Via hun mond stoten ze ultrasone, voor de mens onhoorbare, geluiden uit. Wanneer de geluidsgolven op een object (boom, insect, ...) botsen, dan ontstaat er een echo die wordt opgevangen door de gevoelige vleermuisoren. In de hersenen worden al deze signalen verwerkt en krijgt de vleermuis een 'beeld' van zijn omgeving. De watervleermuis heeft een frequentie modulerende sonar (FM). Het zijn korte pulsen met een steil frequentie verloop. Dit wil zeggen dat in een korte tijd de frequentie van 100 kHz zakt tot 30 kHz. Dit type van signaal geeft zeer gedétailleerde informatie, maar door de weerstand van de lucht reikt het niet ver.
Watervleermuizen overwinteren in forten en mergelgroeven waar een constant klimaat heerst met temperaturen tussen 3 en 8 °C en een hoge luchtvochtigheid.
In onze contreien is de watervleermuis een bodembewonende soort, waarbij hij een voorkeur heeft voor oude spechtenholen. Uitzonderlijk worden watervleermuizen ook aangetroffen in gebouwen of vleermuiskasten.
Het foerageergebied bestaat uit vijvers, meren, kanalen, rivieren en kleine beken. Hierbij gaat de voorkeur uit naar waterpartijen met bomen langs de oever. De vliegroute naar de jachtgebieden, die gemiddeld 3 - 4 km van de kolonieplaats zijn gelegen, verloopt zonder uitzondering langs landschapelementen zoals dreven, bosranden en riviertjes. Straatverlichting wordt gemeden en een opening van 30 meter in een dreef is voldoende om een andere route te kiezen.
De Watervleermuis vangt zijn prooien valk boven het wateroppervlakte. Het voedsel bestaat bijna uitsluitend uit dansmuggen. Andere prooien zijn langpootmuggen, vlinders en kevers.
De Watervleermuis is geslachtsrijp na 1 jaar. De jongen worden geboren na 15 juni. De jongen zijn vliegvlug na ongeveer 4 weken. Het paarseizoen begint vanaf augustus, ze vinden plaats in de winterverblijfplaats.